凍存管的使用是一門(mén)學(xué)問(wèn)，并不是打開(kāi)液氮罐、放入凍存管、關(guān)上液氮罐這樣簡(jiǎn)單的三部曲可以完成的?？茖W(xué)正確地使用凍存管，可以避免樣本的損失，并保護(hù)試驗(yàn)人員的安全。

　　01細(xì)胞凍存流程

　　1、用預(yù)熱過(guò)的 PBS 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗，棄去 PBS 后，加入含 EDTA 的胰酶消化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化(消化液薄薄地覆蓋細(xì)胞表面即可，消化液濃度須根據(jù)不同的細(xì)胞系進(jìn)行調(diào)整)。

　　2、37℃消化細(xì)胞 3–5 分鐘，不可過(guò)度消化。

　　3、一旦細(xì)胞從底部脫離，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化，并用吸管輕輕吹打以重懸細(xì)胞。

　　4、離心(500 × g, 5 min)細(xì)胞重懸液以沉淀細(xì)胞，棄上清，用含血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行重懸。

　　5、對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(推薦 Neubauer chamber)。

　　6、離心(500 × g, 5 min)細(xì)胞重懸液，棄上清。用適當(dāng)體積含血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

　　7、將細(xì)胞重懸液以 1:1 比例與凍存液(60% 培養(yǎng)基，20% FCS，20% DMSO) 進(jìn)行混合后轉(zhuǎn)移至 Cryo.sTM 凍存管中。凍存管中細(xì)胞的濃度應(yīng)為 1–5 ×10^6細(xì)胞/ml。

　　8、含有細(xì)胞的凍存管須按照 −1 K/min 的冷卻速率進(jìn)行冷凍。將凍存管插在含異丙醇的凍存盒小室并放置在−70℃的冰箱中可以實(shí)現(xiàn)上述要求。如果 凍存液中含有其他類(lèi)型的樣品時(shí)，則需要將 Cryo.s 凍存管在−20℃，−70℃或者液氮的氣相層進(jìn)行直接凍存。為確保每個(gè)樣品的均一凍存效 果，4 ml 和 5 ml 的 Cryo.s凍存管需在−20℃過(guò)夜凍存后再轉(zhuǎn)移至 70℃或者液氮的氣相層。

　　9、然后將 Cryo.s 凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐。為避免污染(例如支原體)并考慮到安全預(yù)防規(guī)范的要求，建議將 Cryo.s 凍存管放置在液氮上方的氣相層而非液氮層。

　　02細(xì)胞復(fù)蘇流程

　　1、從液氮罐中取出凍存管后立即將其置于 37℃水浴中進(jìn)行解凍，解凍時(shí)間約 1–2min，解凍時(shí)需要不停搖動(dòng)凍存管令其盡快融化。此步解凍過(guò)程越快越好。

　　2、將解凍好的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到 15 ml 離心管，并立即添加一定量含血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。

　　3、離心(500 × g, 5 min)細(xì)胞重懸液，棄去上清。用適當(dāng)體積的含血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行重懸后分裝到 1 個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

　　4、請(qǐng)遵循細(xì)胞接種時(shí)的推薦濃度進(jìn)行培養(yǎng)。

　　5、接下來(lái)的 12 個(gè)小時(shí)細(xì)胞需要靜置培養(yǎng)。

　　6、細(xì)胞換液可在 24–48h 后進(jìn)行。